Détermination de l'activité d'un antioxydant par le test DPPH°

Mode opératoire


Matériel et Réactifs

  • Verrerie, pipettes…
  • Spectrophotomètre visible et cuves
  • Ethanol 96° (qualité spectrophotométrie ou HPLC)
  • Solutions de DPPH° (M=394,3 g/mol) :
    • solution mère à 6.10-3 mol/L, stable à -18 °C pendant 1 semaine : peser 0,0236 g de DPPH° dans une fiole jaugée de 10 mL, compléter avec de l’éthanol et placer dans un bain à ultrasons pendant 15 minutes à température ambiante.
    • solution fille à 6.10-5 mol/L, à préparer extemporanément par dilution au 1/100 dans l’éthanol 96° de la solution mère de DPPH°. Vérifier que l’absorbance à 515 nm de cette solution est comprise entre 0,6 et 0,7.
  • Antioxydants : solutions à préparer dans l’éthanol 96° (vérifier qu’elles n’absorbent pas à 515 nm).

Remarque : en fonction de la solubilité des antioxydants, le test pourra être réalisé dans d’autres solvants, sous réserve que le DPPH° y soit soluble.


Protocole

  • Faire le zéro du spectrophotomètre avec de l’éthanol 96°.
  • Dans une première cuve spectrophotométrique, placer 3 mL de la solution fille de DPPH° à 6.10-5 mol/L. Ajouter 77 μL d’éthanol 96°. Mélanger par retournement. Déclencher le chronomètre et mesurer régulièrement l’absorbance à 515 nm (ex : chaque minute pendant 15 minutes puis toutes les 15 minutes). Cette cuve sera appelée cuve témoin et sera conservée à l’obscurité entre deux mesures.
  • Dans une seconde cuve spectrophotométrique, placer 3 mL de la solution fille de DPPH° à 6.10-5 mol/L. Ajouter 77 μL de solution contenant l’antioxydant (molécule pure ou extrait). Déclencher le chronomètre et mesurer régulièrement l’absorbance à 515 nm (ex : chaque minute pendant 15 minutes puis toutes les 15 minutes jusqu’à atteinte d’une valeur constante). Cette cuve sera appelée cuve échantillon et sera conservée à l’obscurité entre deux mesures.
  • Préparer autant de cuves spectrophotométriques que d’échantillons antioxydants à tester (différentes concentrations, différents antioxydants).