Détermination de l'activité d'un antioxydant par le test DPPH°

Matériel et Réactifs

• Verrerie, pipettes…
• Spectrophotomètre visible et cuves
• Ethanol 96° (qualité spectrophotométrie ou HPLC)
• Solutions de DPPH° (M=394,3 g/mol) :
  • solution mère à 6.10^-3 mol/L, stable à -18 °C pendant 1 semaine : peser 0,0236 g de DPPH° dans une fiole jaugée de 10 mL, compléter avec de l’éthanol et placer dans un bain à ultrasons pendant 15 minutes à température ambiante.
  • solution fille à 6.10^-5 mol/L, à préparer extemporanément par dilution au 1/100 dans l’éthanol 96° de la solution mère de DPPH°. Vérifier que l’absorbance à 515 nm de cette solution est comprise entre 0,6 et 0,7.
• Antioxydants : solutions à préparer dans l’éthanol 96° (vérifier qu’elles n’absorbent pas à 515 nm).

Remarque : en fonction de la solubilité des antioxydants, le test pourra être réalisé dans d’autres solvants, sous réserve que le DPPH° y soit soluble.

Protocole

• Faire le zéro du spectrophotomètre avec de l’éthanol 96°.
• Dans une première cuve spectrophotométrique, placer 3 mL de la solution fille de DPPH° à 6.10^-5 mol/L. Ajouter 77 μL d’éthanol 96°. Mélanger par retournement. Déclencher le chronomètre et mesurer régulièrement l’absorbance à 515 nm (ex : chaque minute pendant 15 minutes puis toutes les 15 minutes). Cette cuve sera appelée cuve témoin et sera conservée à l’obscurité entre deux mesures.
• Dans une seconde cuve spectrophotométrique, placer 3 mL de la solution fille de DPPH° à 6.10^-5 mol/L. Ajouter 77 μL de solution contenant l’antioxydant (molécule pure ou extrait). Déclencher le chronomètre et mesurer régulièrement l’absorbance à 515 nm (ex : chaque minute pendant 15 minutes puis toutes les 15 minutes jusqu’à atteinte d’une valeur constante). Cette cuve sera appelée cuve échantillon et sera conservée à l’obscurité entre deux mesures.
• Préparer autant de cuves spectrophotométriques que d’échantillons antioxydants à tester (différentes concentrations, différents antioxydants).