Quelles sont les bases de l'HPLC ?
Exercice 3 : analyse de composés azotés.
La séparation de différents composés azotés est réalisée sur une phase stationnaire de silice greffée C18 (voir figure 1).
Les dimensions de la colonne sont les suivantes : L = 150 mm, Di = 4,6 mm, dp = 5 μm.
Conditions initiales :
La phase mobile est un mélange d’acétonitrile (ACN) et d’H2O dans des proportions 75/25. Le débit de la phase mobile est de 1 mL/min. La détection est réalisée grâce à un détecteur UV à une longueur d’onde λ= 220 nm et la température de la colonne est maintenue constante à 30°C.
3)Les pics chromatographiques 3, 4 et 6 proviennent de dérivés d’aniline ou de l’aniline. Sur la base des structures de ces molécules (figure 2) et des conditions chromatographiques, associer un composé (en glissant les molécules sur les cases) à chacun des pics chromatographiques 3, 4 et 6.
1)La chromatographie mise en œuvre pour cette séparation est :
une chromatographie de partage à polarité de phases inversée Voir l’onglet « Un peu de théorie » de cette fiche.
une chromatographie de partage à polarité de phases normale
2)Pour cette chromatographie les temps de rétention dépendent-ils de la température ?
Oui Voir l’onglet « Un peu de théorie » de cette fiche.
Non
Détermination de quelques paramètres chromatographiques
1) Pour le pic 5 du chromatogramme, calculer le facteur de rétention (k) et le nombre de plateaux théoriques (N).
- Facteur de rétention k(5) :
k = 1,01
k = 2,11 Voir l’onglet « Pour en savoir plus » / « Paramètres chromatographiques » de cette fiche : tm = 0,95 min ; tr(5) = 2,95 min, et largeur de la base extrapolée du pic (I) = 0,118 min.
k= 2,11k = 3,57
- Nombre de plateaux théoriques N(5) :
N = 15 216
N = 8 887
N = 10 000
N = 10 000Après avoir repéré sur le chromatogramme la paire de composés la moins bien résolue, calculer la résolution entre les deux pics.
- La paire de composés la moins bien résolue :
Paire de composés 3,4
Paire de composés 5,6
Paire de composés 4,5
- Résolution entre les composés de la paire limitante
R = 3,7
R = 1,50
R = 1,41
R = 1,00
Afin d’optimiser l’analyse chromatographique, différents paramètres sont modifiés un à un, toutes les autres conditions chromatographiques initiales restant inchangées.
7)A partir des paramètres que vous venez de déterminer, quel est le chromatogramme le mieux optimisé ?
A
B
C Meilleure résolution entre les pics 4,5 et temps d’analyse le plus court.
8)Attribuer les chromatogrammes A, B et C précédents aux changements de conditions chromatographiques proposés ci-dessous (toutes autres conditions chromatographiques demeurant inchangées par rapport aux conditions initiales). On considère que la porosité de la colonne reste constante entre les colonnes.
- la température de la colonne est diminuée à 25°C
A
B La chromatographie mise en jeu est dite de partage. Les temps de rétention sont dépendants de la température. La baisse de la température entraine une augmentation des temps de rétention. Voir l’onglet « La théorie illustrée » de cette fiche.
C
- la taille des particules est diminuée à 3 µm
A Le nombre de plateaux théorique augmente, l’efficacité est meilleure. De plus, changer la taille des particules n’a pas d’influence sur le temps mort si la porosité reste constante.
B
C
- la longueur de la colonne et la taille des particules ont été diminuées
A
B
C Dans ce cas le tm et les tr sont plus courts (longueur de la colonne) et N est plus grand (meilleure efficacité car le diamètre des particules est plus petit).