Quelles sont les bases de l'HPLC ?
L’injecteur
L’injection est une étape importante dans la chromatographie. Comme son nom l’indique, l’objectif est d’injecter l’échantillon à analyser dans le système d’HPLC.
De manière générale, deux systèmes d’injection vont être disponibles, soit une injection manuelle, soit une injection automatique.
En HPLC, que l’injection soit manuelle ou automatique, l’injection se fait avec une boucle d’injection qui doit être remplie puis sera injectée dans le système. Le volume de la boucle d’injection joue un rôle majeur dans le volume d’échantillon injecté. De manière générale les boucles d’injection vont de 1 à 100 µL.
Injection automatique ou manuelle ?
+ Programmation d’une séquence (plusieurs injections successives sans intervention du manipulateur)
+ Possibilité de programmation de dilution ou dérivatisation automatique
- Demande une rigueur organisationnelle lors de la préparation de la séquence
- Conservation des échantillons lors de longues séquences (nécessite un compartiment réfrigéré)
L’injection manuelle, comme son nom l’indique, implique une manipulation de l’utilisateur pour pouvoir injecter l’échantillon dans la boucle, souvent à l’aide d’une seringue, puis basculer la vanne en mode injection (voir plus bas). Il existe deux façons pour basculer la vanne :
- Si la vanne est manuelle, le basculement se fait en pivotant la vanne de la position « chargement » à la position « injection » (voir plus bas). ATTENTION : dans ce cas, il faut faire attention à ce que le basculement de la vanne corresponde avec le temps 0 d’analyse en l’activant sur le logiciel de l’appareil
- Si la vanne est électronique (électrovanne), alors le basculement est automatique et piloté par le logiciel de l’appareil qui calibre le début de l’injection.
Comment fonctionne l’injection ?
Que l’injection soit automatique ou manuelle, elle se déroule toujours de la même façon et est généralement pilotée par une vanne généralement électronique (électrovanne) qui permet de changer la circulation des fluides dans le système d’injection pour pouvoir tour à tour remplir la boucle d’injection et injecter son contenu dans la colonne. La majorité des électrovannes utilisées en HPLC contiennent 6 voies et peuvent se régler sur deux positions :
- Position de chargement de la boucle appelée « load »
- Position d’injection dans la colonne appelée « inject »
Position « chargement » (load)
Dans cette position, la seringue est connectée avec la boucle puis la poubelle, permettant le remplissage complet de la boucle avec l’échantillon (voir animation).
Pendant le remplissage de la boucle, la pompe est reliée directement à la colonne et permet de faire circuler la phase mobile avant injection.
Attention : il faut charger un volume égal à au moins 5 (voire 10) fois le volume de la boucle d’injection pour être sûr que la boucle soit bien remplie avec l’échantillon de manière homogène !
Position « injection » (inject)
Dans cette position, la boucle est reliée à la fois à la pompe et à la colonne. Ainsi, par la circulation de la phase mobile dans la boucle, l’échantillon est poussé jusque dans la colonne où les composés seront séparés.
Pendant l’injection, la seringue est connectée à la poubelle permettant le rinçage de cette dernière . Le rinçage de la seringue entre deux injection est primordial pour éviter la contamination croisée entre deux échantillons successifs.
