Le principe de la détection de fluorescence se base sur la propriété que possèdent certaines molécules organiques de pouvoir émettre un rayonnement lumineux après excitation par un rayonnement ultra-violet ou proche visible. Un exemple commun de fluorescence se retrouve dans les vêtements réagissant à la lumière noire que l’on peut trouver en boîte de nuit.

En fluorescence, la longueur d’onde du rayonnement émis par la molécule (appelée longueur d’onde d’émission ou λem) est différente et toujours plus élevée que la longueur d’onde du rayonnement d’excitation (appelée longueur d’onde d’excitation ou λex).

Ainsi, l’analyse se fera à l’aide d’un couple λex/λem qui est bien plus sélectif que la longueur d’onde d’absorption UV. Cette méthode permet donc des analyses plus spécifiques et bien plus sensibles qu’avec un détecteur UV (lorsque les molécules fluorescent, ce qui n’est pas le cas de toutes les molécules absorbant en UV).

Contrairement à un détecteur UV, les modules composant un détecteur de fluorescence doivent être disposés en respectant un angle (souvent 90°) au niveau de la cellule de l’échantillon. Si la source lumineuse et le détecteur étaient alignés, la détection de fluorescence serait perturbée par le rayonnement lumineux d’excitation. L’angle permet donc de s’assurer que le rayonnement détecté ne provient que de la fluorescence de l’échantillon.