Protocole

1. Choisir la cuve :

La cuve est choisie en fonction de la longueur d'onde : le verre ne permet pas d'analyse en dessous de 330 nm, le PMMA en dessous de 300 nm et le polystyrène en dessous de 340 nm. Les cuves en polymères sont jetables. Le quartz (en fait de la silice SiO₂ fondue) permet de travailler jusqu'à 200 nm.

 

épaisseur 1 mm verre	épaisseur 10 mm verre	épaisseur 10 mm "quartz"	épaisseur 50 mm verre	épaisseur 10 mm verre, petit volume	épaisseur 10 mm verre, très petit volume	épaisseur 10 mm plastique, rétrécie

L'épaisseur de le cuve est choisie en fonction de la sensibilité recherchée (mais plus de 95% des analyses sont faites avec une épaisseur L égale à 1 cm. Si le volume de l'échantillon est limité, on pourra choisir une cuve rétrécie.

2. Allumer, s'il ne l'est pas, le spectromètre

s'assurer que la bonne source est connectée. Deux sources sont nécessaires pour couvrir le domaine 200 - 800 nm : une lampe dite "tungstène" (symbole W) couvre le proche UV, à partir de 330 nm et le visible ; une lampe au deutérium (symbole D2) couvre l'ultraviolet en dessous de 330 nm.

La figure ci dessous montre, sur deux spectromètres différents, le genre d'instruction qu'il faut chercher pour accéder à l'allumage de la source quand un interrupteur dédié n'est pas présent sur l'appareil.



 

Les spectromètres sont souvent dotés de compteurs qui permettent de mesurer la durée de vie des lampes ; un changement automatique de lampe est aussi souvent prévu vers 320-340nm. Il faut ensuite vérifier que le spectromètre est en mode "photométrie".

3. Sélectionner la longueur d'onde de travail :

La longueur d'onde λ_travail est fournie par le protocole ; sinon se reporter ici. Sur le panneau de contrôle du spectromètre, régler la longueur à la valeur voulue.

Les étapes suivantes sont décrites pour un appareil à simple faisceau.

4. Mesure de I₀ ou "blanc" :

Vérifier qu'il n'y a pas d'échantillon, fermer le capot du compartiment de l'échantillon, appuyer sur la touche : "100%T" ou "zéro".

Faire le blanc : remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les constituants du mélange à analyser, SAUF l'espèce à doser. Autrement dit, remplir une cuve avec le solvant, le tampon, les éventuels réactifs qui interviennent pendant le dosage. Vérifier l'absence de coulure sur les faces optiques (non dépolies) de la cuve et la placer sur le trajet du faisceau lumineux. Femer le capot. La lumière qui émerge de cette cuve permet au spectromètre d'évaluer I₀ envisagée non pas comme intensité lumineuse fournie par la source du spectromètre, mais comme intensité arrivant au détecteur lorsque toute les conditions d'analyse sont réunies, sauf la présence de l'espèce chimique qu'il s'agit de doser. Si l'absorbance dépasse 1, les constituants du blanc absorbent déjà plus de 90% de l'intensité lumineuse. Les conditions d'analyse deviennent discutables. Sinon, appuyer sur le touche 100%T ou "zéro".

5. Mesure de I et A

remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les constituants du mélange à analyser, Y COMPRIS l'espèce à doser. L'intensité de la lumière qui émerge de cette cuve correspond à I₀ diminuée de l'absorption due à la l'espèce à doser. Relever l'absorbance lue et la reporter sur la courbe d'étalonnage ; en déduire la concentration recherchée.

• Si la valeur de l'absorbance dépasse 1, il existe un risque que cette grandeur soit sortie de la zone de linéarité de la loi de Beer-Lambert. Il est préférable de renouveler la mesure en diluant ou en préparant à nouveau l'échantillon. Refaire le blanc, si nécessaire.
• Si l'absorbance évolue : le contenu de la cuve évolue aussi. Une réaction a lieu, qui conduit à la formation de davantage de composé coloré (cas fréquent lorsqu'il faut ajouter un réactif) ou au contraire à la décomposition de la molécule qui absorbe.