Dans un étalonnage interne, on va rajouter un composé (appelé étalon interne) dans toutes les solutions étalons. Les solutions étalons contiennent donc les composés à doser, à des concentrations croissantes, ainsi qu’un étalon interne rajouté à la même concentration dans tous les points de gamme. Cet étalon interne sera rajouté, à cette même concentration, dans tous les échantillons à doser.

L’étalonnage est donc plus compliqué à mettre en œuvre que l’étalonnage externe – en pratique, on met en œuvre un étalonnage interne lorsque la méthode d’analyse manque de répétabilité ou de reproductibilité. Un exemple classique d’application est la chromatographie en phase gazeuse, pour laquelle les volumes injectés sont difficilement répétables.