La fluorescence est caractérisée par son spectre (longueurs d'onde d'excitation et d'émission) et son intensité.

Spectre

Il est possible d'enregistrer deux types de spectre en fluorescence, le spectre d'excitation et le spectre d'émission.

Le spectre d'excitation est réalisé en fixant la longueur d'onde d'émission de fluorescence et en balayant la longueur d'onde d'excitation. Il permet de déterminer la longueur d'onde d'excitation maximale. Il est semblable au spectre d'absorption pour une molécule seule en solution.

Le spectre d'émission est obtenu en fixant la longueur d'excitation et en balayant la longueur d'onde d'émission de fluorescence.

D'après le diagramme de Jablonski:

• Le spectre d'émission (S₁-S₀) est l'image opposée du spectre d'excitation (S₀-S₁)
• La longueur d'onde de fluorescence ne dépend pas de la longueur d'excitation
• La longueur d'onde de fluorescence est légèrement supérieure à la longueur d'onde d'absorption puisqu'il y a eu perte d'énergie par désexcitation vibrationnelle (à la base de l'effet Raman). C'est ce qui est appelé déplacement de Stokes.

Intensité

L'intensité de fluorescence est la quantité de photons émis par unité de temps et par unité de volume. Elle dépend de la concentration de l'échantillon, de la longueur d'onde d'excitation et de son rendement quantique.

Les molécules possédant des transitions π → π* ont un rendement quantique élevé. Ce sont donc des molécules hautement fluorescentes. En augmentant la conjugaison des électrons π, le rendement de fluorescence ainsi que la longueur d'onde d'émission augmentent.

La fluorescence est une méthode de détection très sensible. En effet, l'intensité de fluorescence est la mesure d'un signal par rapport au bruit de fond donc il est possible de mesurer des signaux d'intensité très faible. Elle peut être 1000 fois plus sensible que l'absorption qui est la comparaison entre deux signaux très peu différents et très intenses (Intensité incidente/intensité transmise).