Quelles sont les bases de l'HPLC ?
La détection
Les différents détecteurs
De nombreux détecteurs peuvent être utilisés en HPLC. Toutefois, trois détecteurs sont aujourd’hui majoritairement utilisés pour la détection de la chromatographie liquide :
Le chromatogramme
Le chromatogramme est la représentation en 2 dimensions du signal analysé par chromatographie. Les deux dimensions communément retrouvées sur un chromatogramme sont le temps et l’intensité du signal (ex : absorbance, luminescence, conductivité, m/z). Ainsi, sur le chromatogramme, les composés élués de la colonne seront représentés sous forme de pics (visibles sur la figure ci-dessous).
Certains détecteurs sont capables d’acquérir en simultané plusieurs signaux (plusieurs longueurs d’onde ou m/z) permettant de tracer des chromatogrammes en trois dimensions. Les chromatogrammes en trois dimensions sont cependant peu utilisés en chromatographie car le traitement du signal est complexe et nécessite des outils mathématiques avancés.
La quantification
La quantification des composé analysés en HPLC se base sur les pics visibles sur le chromatogramme.
Le paramètre utile pour la quantification est soit l’aire du pic, soit la hauteur du pic. De manière générale, la quantification est préférée en utilisant l’aire du pic plutôt que sa hauteur. L’aire du pic s’obtient via les logiciels d’intégration vendus avec les appareils de chromatographie.
Vous pouvez voir sur le chromatogramme ci-dessous un pic qui a été intégré automatiquement par le logiciel. Malgré la bonne capacité des logiciels récents, il faut rester vigilant à l’intégration de chaque pic, car une mauvaise intégration peut générer des erreurs importantes dans la quantification des composés.
Intégration d’un pic chromatographique
Pour qu’une quantification soit correcte, il faut respecter plusieurs points importants :
- L’intégration doit commencer avant l’épaulement de début du pic
- L’intégration doit finir après l’épaulement de fin du pic
- L’intégration ne doit pas être trop distante de ces deux épaulements
- La ligne d’intégration doit être dans le prolongement de la ligne de base du chromatogramme
Si tous ces critères sont respectés alors l’intégration est correcte et la quantification pourra être faite en utilisant la méthode de l’étalonnage