Quelles sont les bases de l'HPLC ?
Le spectromètre de masse
Contrairement aux autres détecteurs de spectrométrie, le spectromètre de masse (souvent noté MS pour mass spectrometer) n’analyse pas les analytes en fonction de leur propriété vis-à-vis de la lumière, mais par rapport à leur masse moléculaire.
Pour cela, la spectrométrie de masse a besoin de générer des ions qui seront ensuite analysés selon le rapport entre la masse moléculaire (exprimé en Dalton ou Da) et la charge de l’ion généré. Ce rapport s’écrit conventionnellement m/z.
Tout spectromètre de masse se compose de trois compartiments visibles sur le schéma ci-dessous (plus de description en cliquant sur le module):
La source d’ionisation
Lors d’un couplage entre un HPLC et un spectromètre de masse (HPLC-MS), la source d’ionisation a deux fonctions majeures :
- Générer les ions à partir des analytes qui ont élué de la colonne
- Evaporer la phase mobile liquide qui perturberait grandement l’analyse des ions générés.
Positionner la source d’ionisation à 90° par rapport à l’analyseur permet d’éliminer les analytes qui ne se seraient pas ionisés, Les ions sont eux dirigés vers l’analyseur à l’aide d’un champ électrique généré par la différence de potentiel.
Il existe plusieurs possibilités de sources d’ionisation pour l’HPLC-MS ; la plus utilisée est l’électronébulisation (electrospray ou ESI) qui vise à former un spray de la phase mobile – ce spray est constitué de gouttelettes chargées en ions en raison du très fort potentiel électrique qui existe entre la source d’ionisation et l’entrée de l’analyseur. Le passage d’un gaz inerte à contre-courant va permettre l’évaporation de la phase mobile, de manière à avoir en sortie de la sources des ions. Ces conditions d’ionisation étant très douces, cela génère peu ou pas de fragmentation des molécules.
L’analyseur
L’analyseur en MS permet de séparer les différents ions générés par la source d’ionisation en fonction de leur rapport m/z.
Bien qu’il existe plusieurs principes et technologies d’analyseur en spectrométrie de masse, deux paramètres fondamentaux sont essentiellement mis en œuvre: l’inertie des molécules (en fonction de m) et l’électromagnétisme des ions (en fonction de z). Les plus employées sont le quadripôle (Q), le temps de vol (ToF ou Time of Flight) ou encore l’orbitrap.
Les caractéristiques importantes d’un analyseur sont :
- La résolution: capacité à différencier deux analytes ayant des rapports m/z très proches
- La gamme de m/z: plus elle est importante, plus l’analyseur pourra fonctionner sur des molécules variées
- La vitesse de balayage: paramètre qui permet d’évaluer la rapidité à changer le rapport m/z analysé en cours d’analyse pour détecter plusieurs analytes simultanément
- La sensibilité: plus elle est importante, plus l’analyseur sera performant même à de très faibles concentrations.
Chaque type d’analyseur a des points forts et des points faibles sur l’ensemble des caractéristiques. Le choix se fait donc en fonction de ce que l’on veut mesurer.
Le détecteur
Le détecteur est la dernière étape de l’analyse par MS. Les ions ont été générés puis séparés dans l’analyseur, ils doivent maintenant être détectés (comptés) afin de retranscrire le signal.
Comme pour la source d’ionisation ou l’analyseur, il existe plusieurs types de détecteur.
Le détecteur historique en MS est la plaque photoélectrique. Ce détecteur est cependant peu sensible et ne permet pas une analyse rapide des données. Plus récemment, le détecteur préféré en MS est le multiplicateur d’électrons. Ce détecteur se compose d’un cône de verre dopé au plomb (Dynode) où les ions sortant de l’analyseur vont ricocher en décrochant de nouveaux ions amplifiant ainsi le signal. Ce détecteur offre une très bonne sensibilité grâce à la l’amplification du signal, mais perd en précision.