Quelles sont les bases de l'HPLC ?

Les paramètres chromatographiques

Le temps de rétention (tr)

Le temps de rétention est le temps nécessaire à un composé pour éluer de la colonne et être détecté. Conventionnellement, le temps de rétention est déterminé au sommet du pic chromatographique qui correspond généralement à la moitié de l’élution du composé.

Chromatogramme présentant 4 pics, tr1 à tr4.

Le facteur de rétention (k)

Le facteur de rétention k (anciennement appelé facteur de capacité et noté k’) permet d’appréhender la capacité de la colonne à retenir le composé dans les conditions d’élution paramétrées. Pour déterminer le facteur de rétention, il faut pouvoir connaitre le temps mort^* (t_m) et le temps de rétention du composé concerné (t_rx). Le facteur de rétention se détermine avec la formule suivante :

$k = \frac{tr_{i} - t_{m}} {t_{m}}$

où
tr_i : temps de rétention du composé i
t_m : temps mort de la colonne

Si
k ≤ 1 : l’élution est trop rapide
1 k ≥ 5 L’élution est trop lente

Chromatogramme anoté. Un premier pic se situe au temps d'élution tm. Un second au temps d'élution tr1.

*Temps mort (t_m) : le temps mort est le temps minimum, après injection, nécessaire à un composé pour traverser la colonne et être analysé. Pour déterminer le temps mort de la colonne, il faut utiliser un composé qui n’est pas retenu par la colonne et qui éluera avec la phase mobile sans interaction avec la phase stationnaire.

Efficacité de la colonne ou nombre de plateaux (N)

L’efficacité d’une colonne se détermine généralement par le nombre de plateaux théorique que la colonne aura vis-à-vis du composé considéré. Le nombre de plateaux théorique correspond au nombre de fois qu’un composé sera échangé entre la phase mobile et la phase stationnaire. Ainsi le passage d’un composé de la phase mobile vers la phase stationnaire puis le retour vers la phase mobile représente un plateau.

Le nombre de plateaux théorique peut se déterminer avec la formule suivante :
$N = 16(\frac{tr_{i}} {I_{i}})^{2}$

où
tr_i : temps de rétention du pic i
I_i : largeur à la base du pic i

Plus le nombre de plateaux est élevé et plus l’efficacité de la colonne est importante et plus le pic du composé sera fin.

Schéma présentant une succession de rectangles superposés verticalement, chaque rectangle représentant un plateuu. Chaque plateau est divisé en 2 horizontalement, à gauche la phase mobile et à deoite la phase stationnaire. Des flèches doubles symbolisent les échanges entre les deux phases.

La résolution

La résolution R_S d'une colonne est la mesure quantitative de son aptitude à séparer deux analytes A et B. Elle se calcule avec la formule suivante :
$R_{s} = 2(\frac{tr_{2} - tr_{1}} {I_{2} + I_{1}})$

Où :
tr₁ : temps de rétention du pic 1 (ou2)
I₁ : largeur à la base du pic 1 (ou2)
La résolution ne se calcule qu’entre deux pics adjacents - plus la résolution sera élevée et plus la séparation des deux pics sera bonne.

Une résolution supérieure à 1 voire supérieure à 1,5 est nécessaire pour avoir une bonne intégration des pics et donc un bon calcul de l’aire du pic.

R_s ≤ 0,75
Mauvaise séparation

R_s ≈ 1
Séparation incomplète

R_s ≥ 1,5
Séparation complète

courbe verte présentant 2 pics, au temps tr1 et tr2, d'intensité I1 et I2